CRISPR und Stammzellen - Zellidentität verändern und Leben retten

Laut dem United Network for Organ Sharing wird alle zehn Minuten jemand zur Spenderliste hinzugefügt. Gleichzeitig sterben im Durchschnitt 20 Menschen pro Tag und warten auf eine Orgel. Alleine im Jahr 2016 starben mehr als 7.000 Patienten auf der Warteliste…

Wenn es etwas Schlimmeres als Sterben gibt, wartet es darauf, ob Sie tatsächlich sterben werden oder nicht. Und du weißt es nie.

Es muss etwas passieren. Zum Glück war es so. Vor zehn Jahren haben Takahashi und Yamanaka von der Universität Kyoto, Japan, somatische Zellen erfolgreich in induzierte pluripotente Stammzellen transformiert - ein Zelltyp, der dem aus unserem Embryo extrahierten ähnlich ist. Mit anderen Worten, sie können jede Zelle aus Ihrem Körper, die nicht reproduzierbar ist, in eine embryonale Zelle verwandeln, die sich auf unbestimmte Zeit teilen, proliferieren und in einen Zielzelltyp wie Blutzellen oder Neuronen differenzieren kann.

Diese Kardiomyozyten wurden aus normalen adulten menschlichen Hautproben umprogrammiert. Bildnachweis: Matt Spindler / Gladstone Institutes

Lassen Sie uns nachlesen und verstehen, wie das wirklich funktioniert!

Cellular Reprogramming: „Das Yamanaka-Experiment“

Die Idee war einfach: Ein kleiner Satz von Transkriptionsfaktoren (TFs) kann, wenn er in einer Körperzelle exprimiert wird, diese in einen pluripotenten Zustand zurückprogrammieren. Sie können sich TFs als einen Lehrer vorstellen, der den Zellen sagt, was zu tun ist. Wenn die Zellen die richtigen Anweisungen erhalten, bewegt sie sich in die richtige Richtung. Nach einiger Analyse nahm das Yamanaka-Team 24 Kandidatengene, die hauptsächlich aufgrund ihrer hohen Expression und Spezifität in pluripotenten Zellen ausgewählt wurden. Anschließend bauten sie die Gene tragenden Retroviren in adulte Körperzellen (z. B. Hautzellen) ein, um sie zu exprimieren. Nach einer Inkubationszeit führen sie ein Markergen ein, das nur in pluripotenten Zellen aktiviert wird.

Sie setzten den Prozess fort, um den Cocktail der Gene auf vier Umprogrammierungsfaktoren einzugrenzen: Klf4, Sox2, Oct4 und Myc, a.k.a. KSOM.

Kurz gesagt, sie haben bewiesen, dass durch die Einführung dieser vier Faktoren in alle somatischen Zellen die Zellen pluripotent werden und die Fähigkeit haben, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und Gewebe zu bilden.

Im wirklichen Leben dominieren Erwachsene die Welt. Aber in den zellulären Welten sind sogar „Erwachsene“ gezwungen, „Babys“ zu werden, um die Supermacht zu haben, unsterblich zu sein, sich weiter zu teilen und ihr Leben neu zu gestalten, indem sie zu dem Zelltyp werden, den wir uns wünschen.

Diese iPSC-abgeleiteten Neuronen wurden aus Gewebe von menschlichen Patienten mit Huntington-Krankheit erzeugt. Die Hoffnung für die Zukunft ist, dass abnormale Zellen von Patienten mit Erbkrankheiten wie Huntington in den pluripotenten Stammzellzustand umprogrammiert, mit CRISPR „bearbeitet“ und dann in Patienten transplantiert werden können, um die normale Funktion wiederherzustellen. Bildnachweis: Julia Kaye / Gladstone Institutes

Weit über iPSC-basierte Zellersatztherapien hinaus

In der Grundlagenforschung hatte die Fähigkeit, iPSCs aus den Zellen von Patienten abzuleiten, einen enormen Einfluss auf die Modellierung menschlicher Krankheiten. Seit Jahrzehnten modellieren wir genetische Krankheiten und führen Drogentests oder Gentherapie-Experimente an Tieren wie Mäusen oder Zebrafischen durch.

Mit der iPSC-Technologie können wir nun familiäre genetische Erkrankungen im Kontext von vom Patienten abgeleiteten Neuronen und Geweben untersuchen.

Abgebildet ist eine mikroskopische Ansicht von Gehirnzellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen im Labor des Neurowissenschaftlers Su-Chun Zhang der Universität Wisconsin-Madison erzeugt wurden. Die induzierten Zellen, die von umprogrammierten Hautzellen stammen, scheinen viele der universellen Eigenschaften menschlicher embryonaler Stammzellen zu haben.

Das Aufkommen von iPSCs brach auch das „Krebszelllinien-Monopol“. Bisher waren Krebszellen die einzige zuverlässige Quelle für menschliche unsterbliche Zellen. Wie Krebs sind iPSCs unsterblich, leiden jedoch nicht unter den Nachteilen der pathologisch veränderten Genome von Krebszellen, behalten jedoch ihre Fähigkeit bei, sich in jeden interessierenden Zelltyp zu differenzieren. Im akademischen Bereich hat das Allen Institute for Cell Science eine Bibliothek mit charakterisierten iPSCs in industriellem Maßstab auf den Markt gebracht, die zur Erstellung eines visuellen, animierten Modells der Zelle verwendet werden soll, was darauf hindeutet, dass iPSCs in Kürze Krebszellen als Modellsystem für Basic ersetzen werden Zellen-Biologie.

iPSC ist fantastisch, aber noch nicht perfekt

Eine Herausforderung besteht darin, dass keine einzelnen iPSC-Linien identisch sind und wir nicht sicher sind, wie sich diese Variabilitäten auf das Potenzial einer Linie auswirken, sich in Funktionszellen zu differenzieren.

Einige Unterschiede sind einfach Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP). Jedes SNP stellt einen Unterschied in einem einzelnen DNA-Baustein dar, der als Nukleotid bezeichnet wird. Beispielsweise kann ein SNP das Nukleotid Cytosin (C) durch das Nukleotid Thymin (T) in einem bestimmten DNA-Abschnitt ersetzen. Es gibt Millionen von SNPs in einem menschlichen Genom, und sie variieren zwischen den Menschen. Während die meisten SNPs als nicht codierend oder regulatorisch bekannt sind, erzeugen sie Datenrauschen, wenn wir versuchen, bedeutende genetische Unterschiede zu identifizieren, um eine sichere, effektive klinische Anwendung zu erzielen.

Illustration von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) aus der DNA-Enzyklopädie

Die Dateninterpretationssituation wird durch sporadische polygene Erkrankungen verschärft. Während einige Krankheiten wie das Fragile Syndrom X durch die Mutation eines einzelnen Allels (auch bekannt als Monoallel) verursacht werden, werden andere durch mehrere genetische Risikofaktoren verursacht, wie in den Genome Wide Association Studies (GWAS) - einer genomweiten Assoziationsstudie - dargelegt zwischen verschiedenen Individuen, um zu sehen, ob es eine gemeinsame Variante gibt, die zu einem gemeinsamen Merkmal führt. Diese sind als polygene Krankheiten bekannt (polygone Zahl). Es hat sich gezeigt, dass die Umwelt auch diese vielfältigen Risikofaktoren beeinflusst.

Die FMR1-Transkription wird aufgrund von DNA-Hypermethylierung zum Schweigen gebracht, und das Fehlen von FMRP führt zu einem fragilen X-Syndrom. (Aus
Unsere Priorität ist es, diese Daten zu sortieren, um störende technische / methodische Abweichungen von aussagekräftigen biologischen zu unterscheiden.

Um das Differenzierungspotential von iPSC-Leitungen zu verstehen, ist es wichtig zu verstehen, wie sich die zelluläre Differenzierung am Anfang auswirkt.

Stellen Sie sich die Interaktionen in unserer Zelle als Puppenspiel vor. Es gibt Leute, die dahinter stecken und kontrollieren, wie der Prozess abläuft. Dadurch entstehen verschiedene „Charaktere“ (neben unseren Zellen) mit einer einzigartigen Identität.

Die DNA-Methylierung ist ein Prozess, bei dem dem DNA-Molekül Methyl- (CH3-) Gruppen hinzugefügt werden. In einem Genpromotor wirkt die DNA-Methylierung typischerweise so, dass die Gentranskription unterdrückt wird. (Bild aus Wikipedia)Mögliche Methylierungs- und Demethylierungswege (Bild aus Wikipedia)

Nach einigen Untersuchungen haben Wissenschaftler herausgefunden, dass der Hauptregler die DNA-Methylierung und die Histonmodifikation reguliert. Somit wäre die Anzahl der differentiell methylierten Regionen (DMR) ein wichtiger Faktor für das Verständnis der Differenzierungskapazität von Zellen. Im Grunde muss man nur herausfinden, wie viele DMRs die Puppensteuerung auf der Liste hat und wie viele sich in jeder Zelle befinden.

Es ist auch interessant zu sehen, ob sich ein Geheimagent hinter diesem Puppenprüfer befindet, um ihm mitzuteilen, was zu tun ist. Die Antwort ist ein klares Ja - es ist der Sexfaktor! Während der Neuprogrammierung von Zellen müssen von Frauen stammende somatische Zellen eine zusätzliche Barriere im Vergleich zu von Männern stammenden Zellen überwinden, nämlich die Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms. Darüber hinaus ist bekannt, dass die weiblichen iPSCs mehr X-Chromosomen-lokalisierte DMRs enthalten als die männlichen. In der Tat ist Sex ein wesentlicher Faktor zur Erklärung der unterschiedlichen Methylierungsmuster unter den iPSC-Linien! Ein weiterer Faktor ist das Alter. Daher ist es wichtig, die verschiedenen iPSC-Zelllinien nach verschiedenen Altersgruppen zu unterteilen.

Lassen Sie uns noch einmal zusammenfassen, was wir bisher über das Differenzierungspotenzial von iPSC gewusst haben:

DMRs → Zelltypen unterscheiden. Das Problem „SNP und polygene Krankheiten“ ist jedoch ungelöst. → Daten müssen sortiert werden, um die Auswirkungen jedes Risikofaktors auf die Expression eines bestimmten Merkmals zu kennen.

Okay, cool. Weitermachen. Wir sind fast da!

CRISPR-Cas: Einstieg in das iPSC-Spiel

(Bevor Sie weiterlesen, können Sie dieses Video hier ansehen oder meinen vorherigen Artikel hier lesen, um zu verstehen, wie CRISPR funktioniert.)

Um die Auswirkungen verschiedener Risikofaktoren auf die Ausprägung einer Krankheit zu untersuchen, müssen wir zwei Dinge tun:

  1. Richten Sie eine Kontrollgruppe und eine Testgruppe ein
  2. Schalten Sie jedes Risikofaktorgen einzeln aus, um festzustellen, ob ein Funktionsverlust vorliegt

Die beiden Schritte zur Etablierung einer isogenen Zellinie sind ausgefeilter (wenn Sie wissen, ob sie Ihnen helfen, zukünftige Arbeiten zu verstehen). Isogene Zelllinien werden über einen Prozess erzeugt, der als homologes Gen-Targeting bezeichnet wird. Im Wesentlichen bedeutet dies, dass wir ein Tool wie CRISPR verwenden können, um die gewünschte krankheitsverursachende Mutation oder SNPs einzuschalten oder auszuschalten.

Humane Wildtyp-Epithelzellen werden einem Gentargeting unterzogen, um isogene Derivate zu erzeugen, die eine einzelne onkogene PIK3CA-Mutation (Knock-In) oder dieselbe PIK3CA-Mutation zusammen mit einer onkogenen KRAS-Mutation (Double-Knock-In) enthalten. Die Zellen werden dann parallel mit Medikamenten behandelt, um die Resistenzempfindlichkeit zu bestimmen (J Clin Invest. 2010; 120 (8): 2655–2658. Doi: 10.1172 / JCI44026.)

Jüngste Studien haben gezeigt, dass solche Methoden erfolgreich sind, beispielsweise bei der Entschlüsselung des Einflusses von Parkinson-assoziierten Risikovarianten. Nach Einführung einer häufigen PD-assoziierten Risikovariante in einer nicht kodierenden Enhancer-Region wurde das SNCA-Gen um 10% dereguliert. Denn SNCA ist verantwortlich für die Produktion von Alpha-Synuclein - einem Protein an präsynaptischen Transmittern im Gehirn, an denen Neurotransmitter freigesetzt werden. Der Mangel an SNCA kann die normale Gehirnaktivität stark beeinträchtigen. Dies ist nur ein Beispiel für die Verwendung von CRISPR zur Etablierung isogener Zelllinien zur Eliminierung von SNP („Datenrauschen“) und zur Untersuchung einzelner (oder einer Kombination) oder verschiedener Risikofaktoren bei polygenen Erkrankungen.

Die Auswirkungen von CRISPR in iPSC-Modellen gehen jedoch über die schnelle und effiziente Bearbeitung von Genen hinaus. Wie wir wissen, hat ein katalytisch aktives Cas-Protein zwei Domänen - RuVC-like und HNH - beide fungieren als Schere, um doppelsträngige Brüche (DSB) an unseren gewünschten genomischen Loci zu induzieren.

Durch die Mutation dieser beiden Domänen verlieren sie ihre Schneidfunktion und werden zu einem deaktivierten Cas-Protein (dCas).

Sie fragen sich vielleicht: Warum um alles in der Welt sollten wir die Bearbeitungsfunktion eines Gen-Bearbeitungs-Tools wie CRISPR ausschalten? Die Antwort ist: dCas9 mit anderen funktionellen Proteinen zu fusionieren, um die Genaktivität an einer Zielstelle zu aktivieren oder zu unterdrücken.

  • Wenn dCas9 mit Kruppel Associated Box (KRAB), einer Transkriptionsrepressordomäne, fusioniert wird, wird die Transkription unterdrückt und das System wird als CRISPR-Interferenz (CRISPRi) bezeichnet.
  • Wenn dCas9 mit dem SunTag fusioniert wird, einer Sequenz, die mehrere Kopien der Aktivator-Rekrutierungsdomäne des allgemeinen Kontrollproteins (GCN4) enthält, aktiviert das System die Transkription und wird als CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) bezeichnet.

Die Aktivierung und Unterdrückung bestimmter Gene kann uns helfen, die Funktion dieser Gene zu untersuchen. Durch die Fusion von dCas und fluoreszierendem Reporter können wir außerdem die Organisation des Kerns und bestimmte genomische Stellen sichtbar machen.

Was müssen wir also wissen?

  • Wir brauchen einen Ersatz für Organe in der Spende, und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) sind eine vielversprechende Lösung. Es hat das Potenzial für beide Ersatztherapien und dient als wegweisendes Modell für die Erforschung von Krankheiten.
  • CRISPR hilft bei der Etablierung isogener Zelllinien, um die Auswirkungen mehrerer Risikofaktoren bei polygenen Erkrankungen zu untersuchen, hauptsächlich durch die Erzeugung von Knock-outs. Es beseitigt auch Datenstörungen, indem einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNP) ausgeschaltet werden. Es verleiht den Testzellen eine Art Uniformität, sodass wir das effektivste und zuverlässigste iPSC für die klinische Anwendung finden können.
  • dCas9 aktiviert und unterdrückt Gene, sodass wir ihre Funktionen untersuchen können. Dies kann in genomweiten Screenings verwendet werden, von denen ein beliebter Typ das Funktionsverlust-Screening ist.

Zweifellos ist die Ehe zwischen dem iPSC und CRISPR ein Meilenstein auf dem Gebiet der regenerativen Medizin und ein Schritt in Richtung praktischer klinischer Anwendungen!

Meine persönliche Anmerkung und weitere Lektüre

Die Fortschritte, die ich bei Stammzellen und CRISPR gemacht habe, sind einfach überwältigend. Die kollektiven Bemühungen von Wissenschaftlern während ihres siebenjährigen Studiums von iPSC - etwas, von dem sie nicht einmal wussten, dass es zu diesem Zeitpunkt funktionieren würde - und ihre potenziellen Anwendungen sind äußerst bewundernswert. Sie vermitteln mir nicht nur das Wissen, sondern auch die Einstellung zur wissenschaftlichen Forschung - Geduld, Optimismus und Beharrlichkeit.

Wenn Sie so aufgeregt sind wie ich und die Zukunft der regenerativen Medizin lieben, empfehle ich die folgenden Lesungen:

  • Engineering von menschlichen Stammzelllinien mit induzierbarem Gen-Knockout unter Verwendung von CRISPR / Cas9
  • Kapitel 2 - Molekulare klinische Genetik und Gentherapie (Kinderchirurgie - Ausgabe 7.0)
  • Der Silberstreifen der induzierten pluripotenten Stammzellvariation
  • Eine Übersicht über induzierte pluripotente Stammzellen, direkte Umwandlung durch Transdifferenzierung, direkte Reprogrammierung und Oligodendrozytendifferenzierung
  • CRISPR / Cas9-basiertes Engineering des Epigenoms
  • CRISPR / Cas-9 in der Genombearbeitung und darüber hinaus
  • Die Nanopartikelabgabe von Cas9-Ribonukleoprotein und Donor-DNA in vivo induziert eine homologationsgerichtete DNA-Reparatur
  • CRISPR / Cas9-Genombearbeitung in humanen hämatopoetischen Stammzellen

Viel Spaß und bleiben Sie dran für meine zukünftigen Artikel!